1970年，Awdeh等做了一有趣的实验，用人肿瘤细胞5563表达一IgG抗体，他们发现原本在IEF胶上同质的抗体进行了脉冲标记实验十分钟立刻呈现异质性。至此研究者们意识到酶催化和非酶催化的翻译后修饰和降解均能引起抗体异质性，例如错配二硫键、糖基化、N端谷氨酰胺环化、C端赖氨酸剪切、脱酰胺、氧化、糖化、肽键断裂。而后众多实验研究发现抗体的异质性在细胞内加工、细胞外处理、纯化过程及储存过程均能引入，抗体的异质性是不可避免的。因而也需运用多种不同原理的分析方法去分析抗体的异质性。异质性又可继续细分为电荷异质性、疏水异质性、分子大小异质性、高级结构异质性等。其中电荷异质性监测被认为是监控翻译后修饰最灵敏的方法。

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 电荷变异体的概念

由于表面净电荷和电荷分布的差异，导致色谱、电泳行为产生差异，这些存在电荷异质性的蛋白常被称为电荷变异体（药典委翻译，后续以此作为标准叫法）或电荷异构体（Charge Variant）。等电聚焦电泳（IEF）或毛细管等电聚焦电泳（cIEF）中，相对主峰（Main），酸性变异体（Acidic）是pI较低的一类组分，碱性变异体(Basic)则是pI更高的组分。若是采用CEX分析，酸性变异体则在主峰之前被洗脱，碱性变异体比主峰洗脱更晚，AEX和CZE分析则相反。

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电荷变异体的来源分类

2.1 主峰并非是未经修饰或未发生降解的抗体，事实上主要由以下三种典型的翻译后修饰构成。

表1 主峰产生原因 

序号	产生原因	影响
1	N端环化成焦谷氨酸 （N-terminal PyroGlu）	无影响
2	C端赖氨酸缺失 (C-terminal Lys Clipping)	CDC
3	N糖基化中性糖链 (N-Glycosylation)	PK，ADCC，CDC，稳定性

2.2 酸性变异体的形成原因主要是碱性基团的缺失、酸性基团的引入、构象改变及其他与CEX柱结合能力降低的修饰等。

 表2 酸性变异体产生原因

序号	产生原因	影响
1	唾液酸 (Sialic Acid)	PK，ADCC，免疫原性
2	天冬酰胺及谷氨酰胺脱酰胺 (Deamidation)	结合活性，效价
3	二硫键被还原 (Reduced Disulfide Bonds)	稳定性，效价
4	游离巯基发生半胱氨酸化 (Cysteinylation)	稳定性，生物学活性
5	赖氨酸糖化 （Glycation）	聚集
6	O糖基化 （O-Glycosylation）	结合活性，稳定性，PK
7	琥珀酰亚胺（天冬酰胺） （Succinimide from Asn）	结合活性，效价
8	二硫键错配 (Disulfide Bond Scramble)	生物学活性，稳定性，效价
9	三硫键 (Thiosulfide Modification)	无影响
10	马来酸酰脲 （Maleuric Acid）	未知
11	柠檬酸修饰 (Citric Acid Modification)	未知
12	丙酮醛修饰 (Methylglyoxal)	未知
13	硫醚键 (Thioether Linkage)	未知

2.3 碱性变异体的形成原因主要是碱性基团不完全切除、额外碱性基团的引入、构象改变及其他与CEX柱结合能力增加的修饰等。

表3 碱性变异体产生原因

序号	产生原因	影响
1	C端赖氨酸不完全切除 (C-terminal Lys )	CDC
2	N端谷氨酰胺环化不完全 (N-terminal Gln )	无影响
3	脯氨酸酰胺化 (Proline Amidation)	无影响
4	丝氨酸突变成精氨酸 (Ser Mutation to Arg )	未知
5	琥珀酰亚胺（天冬氨酸） (Succinimide from Asp)	结合活性，效价
6	N糖糖基化缺失 (Aglycosylation)	PK，ADCC，CDC，稳定性
7	谷胱甘肽修饰 (Glutathionylation)	稳定性，生物学活性

2.4   还有很多修饰或者降解，其引起的电荷变化不固定。

表4  电荷不固定的修饰或降解情况汇总表

序号	产生原因	影响
1	蛋氨酸、色氨酸、组氨酸氧化 (Met、Trp、His Oxidation)	稳定性，PK，结合活性
2	碎片 (Fragments)	生物学活性，PK，免疫原性
3	聚体 (Aggregates)	生物学活性，免疫原性，效能
4	天冬氨酸异构化 (Iso-Asp)	结合活性，效价
5	信号肽不完全切除 (Incomplete Removal of Signal Peptide)	未知
6	高甘露糖 (High Mannose)	PK，ADCC，CDC
7	氨基酸突变 (Amino Acid Mutation)	未知

其中关于高甘露糖，有研究者发现酸性变异体中富集大量高甘露糖糖型，此糖型虽为中性糖，但其可能因为改变了蛋白构象，进而影响了蛋白与离子交换柱的结合而使高甘露糖修饰的蛋白呈现酸性变异体性质；另有研究结果显示在碱性变异体中甘露糖修饰大量富集，但有研究者单独研究含高甘露糖糖型的Fc段与聚体或电荷变异体的形成，两者又无显著相关性。甘露糖型与电荷异质性的影响仍需进一步研究。

为了更清晰的呈现这些修饰或降解对电荷的影响，此处引用张伯彦先生之前培训的一张PPT。具体的翻译后修饰成因和影响，将在下一期详细解读。

3 

电荷变异体对抗体药物功能影响

电荷变异体的产生会影响抗体药物的结合能力（Binding）、生物学活性（Bioactivity）、药代动力学（Pharmacokinetic）、免疫原性（Immunogenicity）以及结构稳定性（Stability）等，进而会影响药物的有效性和安全性。2.1-2.4表格中已经对有文献报道的各个修饰或降解易产生的影响进行了归纳总结，但具体情况还是需要根据修饰所在位点进行具体分析。

3.1 电荷变异体对于药物代谢动力学的影响

⑴  有研究者利用化学修饰方式增加抗体正负电荷基团，结果显示改变蛋白和细胞表面靶点的结合，从而影响组织穿透性、组织分布和药代动力学。

⑵  基因泰克公司曾对上市抗体及临床前抗体药物关于电荷变化产生的药代方面的影响做过一个总结，结果表明：①当电荷变异超过一个 pH 单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学；②增加正电荷，会提高药物的组织蓄积，提高血浆清除率（Blood Clearance）；③降低正电荷，会减少药物的组织蓄积，提高药物全身总清除率(Body Clearance)。此结论也被Zheng等其他研究者证实，pI值高的抗体呈现更高的血浆清除率，导致抗体半衰期降低；对于皮下注射的药物也会降低其生物利用度。

⑶  值得注意的是，这些变异体均是通过人为修饰且大量富集某一特定修饰组分得到的。多种修饰混合组成的酸碱性变异体（pI=8.7-9.1）与目的组分或原材料相比，在与FcRn结合能力、PK数值及生物学效能方面并未呈现显著差异，只是酸性变异体与FcRn的结合能力及生物学效能略下降，但均在方法波动范围内。而Gandhi等的研究显示酸性变异体与FcRn结合能力与目的组分相当；碱性组分由于富集了大量聚体，增加了总亲合力，与FcRn的结合能力更强。Jan Visser等也富集了末端脯氨酸酰胺化的抗体(9%)与原低含量组分进行了生物学活性（结合、ADCC和CDC）、药代动力学（AUC 、Cmax）、毒理实验等对比研究，未显示有显著差异。

⑷  或许由于翻译后修饰成分与比例的不同，或许是对pI的贡献不同及pI变化程度不大，导致酸碱变异体在药物代谢方面的影响程度不同而呈现不完全类似的结果，这些均有待近一步研究考证。

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电荷变异体定量分析方法概述

如前述所说，色谱法和电泳法是两种最常用的电荷变异体分析方法，也是目前2015版中国药典收录的两大类用于电荷异质性分析的方法，主要包括离子交换色谱（IEC）、等电聚焦电泳（IEF）、毛细管区带电泳（CZE）、毛细管等电聚焦电泳（cIEF）。

4.1离子交换色谱

离子交换色谱可分为阴离子交换色谱（AEX）和阳离子交换色谱（CEX）。由于大部分抗体都是弱碱性，CEX最为常用的。离子交换方法耐用、分辨率高且不需要特殊专用仪器（高效液相即可），还可以放大用于分离制备电荷变异体做更深入的研究，曾被认为是分析电荷变异体的金标准方法。其优缺点总结如下表5。

4.2电泳法

电泳法包括等电聚焦电泳（IEF）、毛细管区带电泳（CZE）、毛细管等电聚焦电泳（cIEF）。

4.2.1 平板等电聚焦电泳（IEF）因操作繁琐、分辨率低且定量不准确，已逐步被毛细管电泳替代。

4.2.2 目前cIEF又根据成像和检测的差异区分成传统cIEF（需用压力或改变检测器末端电极槽储备液的pH值的方法使溶质通过检测器）和全柱成像等电聚焦毛细管电泳（icIEF，采用全柱成像方式进行检测）。icIEF方法由于聚焦完成后不需要迁移，相比传统cIEF有明显的优势。其优缺点总结在下表5。在2019年3月6日，国家药典委员会发布了《关于单抗电荷变异体测定法（icIEF法）标准草案的公示》，拟收录icIEF法作为测定电荷变异体药典标准方法。

4.2.3  CZE的方法由于使用简单的分离缓冲体系和非涂层毛细管，制样过程简单、方法通用性好，同时可得到高分辨率和高重现性的分离结果，目前也被广泛用于鉴定及电荷异质性检测。

4.3电荷变异体定量结果差异

4.3.1 大部分情况下，电荷变异体基于等电聚焦和色谱分离两种方式上行为一致，但由于分离机理的差异，有时存在细微差异。IEF或cIEF分离电荷变异体基于净电荷差异（Overall Charge Difference ，Apparent pI）；IEC除了净电荷的作用，电荷分布、蛋白几何结构（Distribution of Charge）在分离过程也中起重要作用；IEF和IEC在表征电荷变异体时存在的差异现象已被证明。如天冬氨酸异构化后pI不会改变，在IEC的行为由于构象差异会产生变化。而CZE是基于蛋白电荷和流体力学尺寸（Hydrodynamic Size）差异导致变异体迁移率不同，机理和呈现的结果与另外两类方法存在差异。

4.3.2 源于方法的不同以及分离度差异，目前报道的四种方法对于同一蛋白的定量结果是有差异的（如图4），同时因蛋白不同，酸碱变异体组成和比例也不同，因而不需要像关注聚集体那样限定绝对值，而是监测相关CQA峰的比例差异即可。四种方法中何种方法分辨率最高，也因实际情况而定。

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电荷变异体表征方法概述

5.1酶解对比

应用对应酶进行酶解，对比酶解前后的变化对峰进行定性。如CPB酶切可确定K变异体；唾液酸酶酶切可确定唾液酸峰；Endo-S或PNGase-F酶切可确定N糖引起的变异体等。该方法简单快速，但只可鉴定特定的修饰。

5.2IEC-MS 或CE-MS直接表征

利用挥发性盐开发IEC方法，调整液相联用系统相关部件，可对分离的电荷变异体直接进行质谱分析；另一方面，近几年不断发展的毛细管电泳与质谱联用技术已实现抗体经cIEF或CZE分离后直接进行质谱检测[i]。此两种方法均可实现电荷变异体分离后实时完整分子量鉴定，表征不同电荷变异体的分子量差异，如相差128Da则可判定为赖氨酸变异体；也可用于快速监测抗体稳定性试验中产生翻译后修饰变化。另一方面，结合各类酶酶解试验，去除特定的翻译后修饰干扰，亦可进一步表征其他电荷变异体翻译后修饰情况。当然该方法仍有局限性，一是该方法只能从完整分子量或亚基层面进行测定，分子量较大，对于分子量差别小的翻译后修饰情况，定性误差较大；二是和先分离收集组分再分析相比，无法同时提供活性检测样品；三是蛋白的高糖基化修饰会影响质谱响应值，且糖基化修饰比例复杂，会增加定性分析难度。

5.3分离收集后表征

应用适当的方法分离并富集电荷纯度较高的电荷变异体，进而利用多种分析手段全面检测电荷变异体的差别，比如翻译后修饰、生物学活性、高级结构、药代动力学等。目前文献报道的分离收集方法主要有以下三种。

5.3.1  IEC-HPLC分离收集：通过分段收集或柱体积等比放大后分段收集，再进行浓缩换液得到电荷纯度较高的电荷变异体。该方法可利用已确定的IEC-HPLC方法直接进行分离，但分离量低，收集精度差，难以实现对每个变异体峰进行分离富集，富集过程耗时耗力。

5.3.2  置换色谱（Displacement Chromatography）分离收集：抗体与离子交换色谱柱结合后，用另一种与固定相作用力极强的置换剂（Displacer）通入色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。最终抗体中的电荷变异体按作用力强弱的次序，形成一系列前后相邻的谱带，流出色谱柱，得以分离电荷变异体。Zhang等采用Sachem Expell SP1置换剂，并通过阳离子交换色谱成功分离IgG1电荷异构体，各组分回收率>70%，电荷纯度>90%。该方法上样量大、产率高、分辨率好，正逐步被应用于生物分子的制备性分离与纯化。但置换剂、固定相、流动相的选择均是关键参数，各参数均需要进行大量优化工作。 

图 6  置换色谱分离图谱

5.3.3 自由流电泳（Free Flow Electrophoresis，FFE）分离收集：与上述两种基于色谱分离原理的收集方式相比，自由流电泳是一种基于等电聚焦电泳原理的电荷变异体分离制备工具。自由流电泳的分离单元（可以对应色谱法中的色谱柱）本质为一个腔体。当缓冲液（两性电解质）从一端往另一端流动的同时，在流动方向的两侧加上电压，在流动方向的垂直方向形成pH梯度。待分离物质以恒定浓度和流速随着缓冲液流入端注入分离单元，一方面在电压和pH梯度的作用下等电聚焦，另一方面被缓冲液带动向出口端流动，最终出口端通过96通道流入96孔板。接下来只需要检测96孔板，回收对应孔中的组分，最终实现不同电荷变异体的分离和富集。自由流电泳可达到icIEF高分辨率，完成单个变异体峰分离，同时单次实验分离量可以达到100mg蛋白。但该方法需有特定的仪器，分离过程需加尿素等促溶剂和两性电解质，最终的样品也需要进行浓缩换液等步骤，蛋白稳定性可能会受影响。

随着质量源于设计（QbD）理念逐步在生物制药产业的深入，电荷变异体将是生物药物研发、生产中质量控制必须考虑的因素。对电荷变异体进行有效分离、鉴定，确认变异体对于药物功能方面的影响，进而对纳入关键质量属性（CQA）的变异体进行监控，将有助于实现药物的安全、有效、质量可控。

引用文献：

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