摘 要

生物制药CMC通常包含四个模块：上游培养、下游纯化、制剂灌装和分析质控。下游纯化是将上游得到的细胞培养液澄清后，进行纯化生产从而得到原液的过程。

那么为了在固定的工艺下使产品质量达到预期，就需要确认工艺参数的操作范围，通过工艺设计来控制对药品安全性和有效性有显著影响的关键属性。实验设计(DOE)是一种设计实验并分析所获得信息的技术。这种技术可以使我们在最小数量的实验中建立实验参数与结果的数学模型，找到最佳工艺条件，确定工艺的操作窗口。

本期皓奇星我们便来介绍一下DOE的实验设计方法及其在下游层析工艺中的应用。

01

什么是DOE？

实验设计(DOE，Design Of Experiment)，是研究和处理多因子与响应变量关系的一种方法。它通过合理地挑选实验条件，安排实验，并通过对实验数据的分析，从而建立响应与因子之间的函数关系，或者找出总体最优的改进方案。它可以用最少的实验数量得到最大的信息量并可以发现各个因子之间的交互作用，探索整个实验区间。

在工艺开发期间，利用DOE的实验方法我们可以在众多影响响应值Y值的因子X中确定哪些对响应有显著影响，确定如何改变这些因子的取值使响应达到最佳值。DOE实验通过对实验结果的分析获得传递函数，得到Y与各因子X的关系式。采用DOE的方法，因子X的范围选择广，且可以进行精确的控制，这也使得DOE实验可以探索到整体的最佳方案，使实验结果取得突破性的改善。

02

DOE的基本术语

因子：所有可能影响实验结果的参数。通常可被控制，但也可能不可控制即噪声因子。该参数既可以是数值也可以为种类，比如层析过程中的pH、电导率、盐类型、填料种类等。

响应：一个或多个可测量的变量描述的实验结果。比如层析过程中的回收率、纯度、HCP含量等。

模型/传递函数：在变量统计分析的基础上建立的数学模型。可以描述工艺参数X与响应值Y的关系，并对不可测量的因子采用预测响应，可以量化随机变化的大小。

下图列举了部分层析过程中涉及到的因子X和响应值Y。

03

DOE的一般步骤

● 明确目的，通过历史数据或经验确定实验目标。

● 确定实验的输出结果响应值Y；确定因子X及其水平。

● 确定每个实验因子X的实际取值，并确定实验计划。

● 按照实验计划随机进行实验，并测量输出值Y。

● 整理、分析数据，进行方差分析和回归分析。找出主要影响因素并确定因子X和响应Y的关系式。

● 确定最优的因子组合。

● 在最优的因子组合范围内重复实验，进行验证。

04

DOE常见设计优缺点比较

05
案例分析

在皓阳生物某融合蛋白的亲和捕获过程中，由于细胞培养液中蛋白表达量高且聚集体含量较高，很难达到亲和洗脱液HPLC-SEC纯度和回收率的平衡的情况。于是，采用DOE实验设计进行洗脱条件的优化，试图找到回收率和HPLC-SEC纯度均大于90%的工艺操作窗口。

首先，确定响应值Y为回收率和HPLC-SEC纯度；根据经验确定因子X为洗脱缓冲液的pH（范围3.0-3.8）及盐浓度（范围20mM-100mM）；选择响应曲面设计中CCF模型进行2因素2水平的实验设计，共设计了11组实验（3组中心点）。按照模型列出的实验条件进行亲和层析，收集洗脱液并进行HPLC-SEC纯度检测和回收率的计算，将响应值Y的结果回输并进行统计学分析。                                              

DOE实验结果表明，洗脱液pH及盐浓度均为亲和捕获工艺中纯度和回收率的显著影响因素，在实验条件范围内，pH越高，收率越低，纯度越高。

为了进一步验证DOE实验优化得到的最优洗脱条件，将层析柱直径放大至5cm并用该洗脱条件重复实验，实验结果均达到预期。最终确定了亲和层析洗脱缓冲液pH及盐浓度区间范围，获得的目标蛋白纯度>90%，回收率>90%。该工艺经过10L反应器培养液进行放大验证后，成功应用于3批200L中试生产，工艺方法稳定可行。

随着生物行业的不断发展，产品种类繁多，各种复杂类型的双抗和融合蛋白的开发必将为下游纯化工艺带来挑战和考验。结合实际需求，善用DOE等实验工具，相信再荆棘丛生的路，也终究会豁然开朗，柳暗花明。