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皓奇星 | 蛋白聚体产生的原因,分析方法和调控手段

2022年04月12日 来源:皓阳生物 浏览次数:2388

在蛋白质药物开发和商业化生产、使用过程中,蛋白的聚集被认为是一个主要的挑战。在整个的蛋白药物开发和生产过程中均可能发生蛋白质聚集,如细胞培养、蛋白纯化、成品灌装和存储;此外在病人使用时也可能会出现蛋白质聚集。蛋白质聚集可能对产品质量和活性有显著的负面影响。尽管一些蛋白质的聚集物可以通过可逆解离维持其体内活性,但通常蛋白质聚体会降低或没有生物活性,并且会产生免疫原性,最终导致药物无效。



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聚体产生路径


聚体(Aggregate)通常由抗体分子间通过共价键或氢键等分子间作用力形成的聚合物,是由两个或多个蛋白组成的复合物,其形成过程十分复杂。蛋白聚体可以通过不同角度分成不同类型。


1)化学键类型:非共价聚体(化学键为弱力,如氢键)和共价聚体(主要是通过二硫键相互结合的聚体);


2)是否可逆:可逆聚体和不可逆聚体;


3)聚体大小:小的可溶性聚体(低聚物),如二聚体、三聚体、四聚体,聚体直径一般为几十纳米到几百纳米;亚可见的不溶性微粒,聚体直径一般为几百纳米到50μm;可见异物,聚体直径一般50μm以上。


1.1 低聚物形成

蛋白质是带电的两亲性物质,许多蛋白质已经被证明可以形成可逆的低聚体。蛋白质相互作用的多样性使得蛋白质聚集形成机制复杂化,蛋白质自然形成低聚物主要的作用力有静电相互作用、疏水相互作用、氢键、范德华力;蛋白质聚集的主要驱动力取决于蛋白质结构、溶液组成和所处的环境。


1.2 聚体的增长

最初的低聚物都可以通过多种机制生长成更大的聚合体,总体生长通常在时间上呈非线性。蛋白质聚合生长的相对速率主要取决于蛋白胶体稳定性、构象稳定性和蛋白之间相互作用。随着蛋白质聚集体体积的增大,它们最终可能变成不溶的、形态不同的微粒,下图展示了聚体形成的过程。



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影响聚体形成的因素

2.1 蛋白质结构

蛋白质的一级序列和疏水氨基酸的相对数量及排列会对聚体含量有很大的影响。疏水性氨基酸容易形成易聚集区域。然而蛋白质的聚集趋势不仅受易于聚集的肽序列控制,还受序列寡肽的两亲性(amphiphilic)比例影响。在特定位置引入一个或多个不同疏水氨基酸可以显著增加蛋白质的聚集形成速率。


蛋白质糖基化对许多蛋白质的稳定性非常重要。抗体中CH2结构域的糖基化可以稳定CH2结构域和整个抗体分子。抗体的去糖基化可能会扰乱CH2结构域的三级结构,并使Fab和Fc区域不稳定,从而加速热诱导的聚集。甚至蛋白质中糖型结构也可以通过影响构象稳定性来改变蛋白质的聚集倾向。


蛋白质的二级结构可能在控制其聚集倾向方面发挥作用,在有游离二硫键蛋白质中,二级结构可以影响二硫键交换的速率,从而影响聚集产生的速率。


2.2 化学降解

在整个蛋白药物的开发、生产和保存过程中蛋白质会经历多种化学降解途径。虽然许多降解途径不会引起可检测的三级结构变化,如氧化、脱酰胺,但化学降解可能会改变蛋白质构象和/或胶体稳定性,从而改变蛋白质的聚集趋势。


蛋白质氧化后的聚集增强至少可归因于以下影响:(1)表面疏水性增强(2)促进聚集-聚集相互作用(3)降低蛋白质的构象稳定性。


脱酰胺后蛋白质聚集的增强可能是由于蛋白质的去稳定性作用和/或蛋白-蛋白相互作用的增强。另一方面,通过脱酰胺作用引入的负电荷可能会潜在地改变整体蛋白质-蛋白质静电相互作用,导致蛋白质聚集增加。


近几年,在生物药中抗体偶连药物(ADC)也越来越多。与抗体相比,ADC的稳定性一般比抗体本身更差。这是因为偶连的(疏水性)药物分子会提高的抗体表面疏水性,小分子药物与抗体比(DAR)的增加会逐步增加聚集倾向。


2.3 温度

温度通过影响蛋白质溶液的多种特性来影响蛋白质聚集,包括蛋白质扩散速度、蛋白质-蛋白质相互作用、构象稳定性和化学降解。温度的升高使化学反应加速,如氧化和脱酰胺反应水平就会更高。温度升高会加速蛋白分子之间的相互碰撞速度,从而也更容易产生聚体。当温度高到一定程度,蛋白高级结构就会打开,从而使疏水基团暴露,进而产生聚体。


2.4 溶液

蛋白稳定性(构象稳定性和胶体稳定性)与蛋白所处的溶液有很强的相关性,其中最重要的条件为溶液的pH,它可以同时影响构象稳定性和胶体稳定性,此外还会影响蛋白质化学降解速度和方向,最典型的就是脱酰胺反应;改变溶液的pH可以改变蛋白的天然结构和蛋白与蛋白之间的相互作用。


另一个影响蛋白质聚集的重要溶液条件是离子强度。离子强度可能通过影响构象稳定性和蛋白质-蛋白质相互作用的性质和程度来影响蛋白质聚集程度。此外,离子强度的影响程度通常取决于溶液的pH值。阳离子和阴离子盐都可以与蛋白质分子相互作用,以特异性结合或非特异性屏蔽调节蛋白质聚集,它们的相对影响可能不遵循hoffmeister series。


此外,在制剂中添加其他辅料可以减少聚体的形成,如精氨酸、蔗糖、海藻糖、山梨醇等多元醇类物质以及表面活性剂;但是一些公认的蛋白质稳定剂在某些条件下实际上可以促进蛋白质聚集。研究发现,在搅拌条件下蔗糖或海藻糖等糖可促进多种蛋白质的聚集。有人提出,高浓度的海藻糖(> 500 mM)可能在蛋白质表面形成簇并竞争水分子,促进蛋白质-蛋白质相互作用。表面活性剂,如聚山梨酯,被证明可以减少蛋白质在振摇和冻融过程中聚集或颗粒形成。但聚山梨酯中的一些杂质会增加聚体的产生,如不溶性脂肪酸,过氧化物,聚氧乙烯脂肪酸酯(POE),脂肪酸脂,醛。


2.5 蛋白浓度

蛋白分子在溶液中做不规则的布朗运动,随着蛋白浓度的增加,蛋白分子之间的相互作用也会增强,相互碰撞几率也会增加,这会导致聚体增加。



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聚体分析方法


生物制药工业中可用于检测、表征、定量和监测生物制药蛋白产品中聚体的分析方法数量在不断的增加。下图列出了用于检测聚体的最常用方法,每种方法都有自身的局限性,需要结合聚体的特性选择合适的方法进行检测。


分子排阻液相色谱法(SEC-HPLC)是对二聚体、多聚体、碎片等蛋白质杂质使用最广泛的分析方法。该方法具有较高的灵敏度、精密度、分离度、准确性,并且可以进行高通量测试。但是作为色谱方法,在检测过程也可能导致聚集,如在样品制备过程中,浓度较高时需要稀释,如果稀释液不合适,稀释过程会产生聚体。同时SEC-HPLC对碎片的分离能力较差,得到的碎片结果有一定误差。同时还要考虑蛋白在流动相和色谱柱的稳定性,它的结果是否代表药品中真实存在的聚集体;另外由于每种方法的局限性,可能需要其他方法进行交叉验证。


SEC-HPLC结果常常用分析型超速离心(AUC))进行确认。分析型超速离心技术的分析方法主要有沉降速率(Sedimentation Velocity)和沉降平衡(Sedimentation Equilibrium)两种。沉降速率是一项流体动力学技术。沉降速率实验中,样品被高速旋转,溶质分子向样品池底部移动,通过记录的数据来测定溶质分子运动的速率。运动速率用沉降系数表示,它取决于分子量、分子形状或构象。对于不同组分的样品,根据不同的沉降系数检测每个组分。沉降平衡是一项热力学技术。沉降平衡试验在较低的转速下进行,当沉降作用与扩散作用达到平衡时测定分子平衡浓度的分布。在平衡状态下,浓度的分布只决定于质量而与分子的形状无关。离心开始时,分子颗粒发生沉降,一段时间以后,沉降的结果造成了浓度梯度,因而产生了蛋白质分子反向扩散运动,当反向扩散与离心沉降达到平衡时,浓度分布固定不变。扫描得到沉降数据后,通过后续软件分析可得到样品表征结果,目前普遍应用SEDFIT/SEDPHAT分析软件,根据分析结果可精准检测生物大分子聚集状态以及聚集体准确百分比含量。但AUC也有自身的缺陷,该设备价格昂贵,设备的使用维护需要专业技术,另外每次检测样品耗时较长,不合适大批量检测。


在用于聚体表征的方法中,场流分离是另一种分离技术,该技术垂直于样品流施加一个力场,使不同大小和分子量的蛋白质分离成为可能。近年来,非对称流场流分馏技术(AF4)被应用于分离。AF4在通道边界处有一个可渗透板块。当样品在通道中流动时,由于层流流动,流体在边界处的速度比在中心处的速度慢,所以形成了抛物线速度剖面。当施加垂直力场时,样品中的分析物被推向边界。布朗运动产生一种抵消运动,使较小的粒子趋向于离边界更远的平衡位置。这种类型的分离范围广,适用于各种洗脱液。


动态光散射(DLS)是利用粒子在溶液中做布朗运动,粒子布朗运动的速度依赖于粒子的大小和媒体粘度,粒子越小,媒体粘度越小,布朗运动越快。这种运动使散射光产生多普勒频移。动态光散射技术(Dynamic Light Scattering,DLS)通过测量样品散射光强度起伏的变化来得出样品颗粒大小的信息。


亚可见不溶性微粒的检测常用光阻法(Light Obscuration)、显微计数法(Light Microscopy)和微流成像技术(Micro Flow imaging)。光阻法(Light Obscuration)和显微计数法已经收录于中国药典和USP<788>章。光阻法通过光电转换的原理自动计数样品中不同粒径的不溶性微粒数量,然而该方法得到的信息有限,它并不能分辨出所测微粒的性质,也无法在研发阶段对其成因进行分析与控制。显微镜法也存在效率较低,容易因人眼疲劳导致计数误差等弊端。微流成像技术(Micro Flow imaging)是最近这十几年发展起来的技术,它将数码显微镜,微流技术和图像处理整合在一起。该技术利用传感器将通过流通池的样品信息生成图像信息,图像中的每个微粒都会创建一个包含计数、大小、透明度、形态等特征信息的数据库。利用微粒的特性可以进行微粒的分类,如玻璃碎屑、硅油、气泡、蛋白质颗粒、胶塞和纤维等,对不溶性微粒的来源或形成机制有提示作用。



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聚体的调控


4.1 蛋白质结构

一级序列及其高阶结构可能决定蛋白质的聚集倾向,在进行蛋白分子设计和成药性分析阶段得到一个好的分子是降低聚体最有效的方法。去除或修饰一个聚集“热点”可以缓解蛋白质的聚集。在某些情况下,这可以通过分析蛋白质序列或疏水性区域来实现。蛋白质表面电荷的修饰也可以改善蛋白质的溶解性和聚集倾向。经常能见到通过单个突变就可以有效地减少蛋白质聚集。然而,关键区域的关键氨基酸的去除或修饰可能会影响蛋白质活性。如果无法得到理想的分子时,就需要通过工艺开发来优化。


4.2 细胞培养

在细胞培养过程中可以通过调节培养液的理化环境来控制抗体的聚体水平,如温度,pH以及渗透压等。王杰等人发现在培养基中添加半胱氨酸能显著抑制多聚体的形成,培养基中半胱氨酸添加浓度增至30mM,多聚体含量下降40%。而铜离子的添加浓度从50mM降至0mM,多聚体含量则降低了43%。培养温度从35℃降低至32℃,重链结合蛋白(Bip)和蛋白二硫键异构酶(PDI)的表达水平均提高了89%,细胞翻译后修饰能力显著加强,分泌至上清液中的抗体多聚体含量相应下降了38%。聚体水平还会随着培养液pH和渗透压的升高而降低,增加培养液中氯化钠的含量可以提高渗透压,进而降低聚体水平;研究发现,培养周期越短,聚体的含量就越低,因此,当产量达标时,上游可通过减少培养时间来降低聚体含量。


4.3 蛋白纯化

如果细胞培养过程中不能降低高聚体含量,则可通过纯化工艺的优化来降低聚体的含量:纯化中缓冲液的类型是影响聚体含量的重要因素,在纯化中,Protein A洗脱抗体时使用的酸性缓冲液会导致聚体的形成。研究发现,与柠檬酸盐、甘氨酸及组氨酸相比,此步骤的缓冲液中精氨酸的加入可降低收获液中聚体的含量。此外还可利用阳离子层析或疏水层析、复合层析等方式将聚体去除。研发阶段如果蛋白聚体含量较高,也可以利用分子排阻色谱柱进行去除,但该方法会损失较多收率,且放大有较大难度,在抗体生产中较少使用。


4.4 制剂处方

在得到纯度较高的蛋白后,保存在何种溶液中会直接影响产品后续的聚体含量。主要方法包括调整溶液pH值或离子强度,以及使用稳定剂。正如前文所述,pH和离子强度对蛋白质多项特性影响,从而对聚体含量造成影响。在开发合适的制剂处方时,得到合适的pH和缓冲液种类是制剂处方开发最重要的一步。


此外,使用蛋白质稳定剂是减少蛋白质聚集的常用策略。稳定剂通过增强构象稳定性、胶体稳定性或溶解度,可以显著缓解蛋白质聚集。糖是另一类常用的蛋白质稳定剂,可在各种条件下对抗蛋白质聚集。值得注意的是,精氨酸作为一种有效的辅料,可以很大限度地减少蛋白质聚集。精氨酸稳定蛋白质主要作用机制可能是由于它可通过静电、疏水残基(如Trp)相互作用被优先排除在蛋白质-蛋白质相遇复合物中,从而起到减缓蛋白质-蛋白质的关联反应作用,最终达到减少聚体的效果。


此外,非离子表面活性剂是一类常用于制剂中的辅料,常常用于抑制振摇和冻融对蛋白质稳定性的破坏。表面活性剂通过降低蛋白质的自缔合、吸附到疏水区域和/或与蛋白质弱相互作用的其他聚集倾向来减少蛋白质的聚集。在空气-水界面,它们的疏水性胜过蛋白质分子,可以阻止蛋白质从疏水界面展开。表面活性剂还能阻止蛋白质分子吸附到其他疏水分子上,以及生产过程中存在的表面。蛋白质配方中聚山梨酯20和聚山梨酯80是最常用的两种非离子表面活性剂。


在蛋白质生产过程或存储过程中(预灌封注射器中),不可避免的有微量金属离子进入溶液中,金属离子会催化蛋白质中某些氨基酸残基 (如Met、 Cys、His、Trp)。在生产过程中蛋白质可能会无意中暴露在微量消毒剂中,如过氧化氢;在保存过程中会遇到产生自由基的条件,如光照、跌落等。如果蛋白对金属离子和氧化剂比较敏感,可以添加少量螯合剂和抗氧化剂,制剂中常用的螯合剂和抗氧化剂为EDTA和蛋氨酸。


4.5 冷冻干燥


如果通过制剂筛选得到配方无法将蛋白质聚集或降解控制到令人满意的水平,通常会选择冷冻冻干方法。但由于冻干过程可能会导致蛋白质聚集,同时冻干也是一个耗时耗能较大的工艺过程,因此需要开发一个最佳的冻干工艺,以减少冻干诱导的聚集及减少时间和能耗。例如,选择合适降温速率、一次干燥温度和压力。此外,有报道退火工艺可以通过降低表面分数和系统的全局流动性,以降低存储期间的聚集率。制剂配方冻干产品稳定性同样重要,因为有些蛋白质稳定剂可能并不适用于冻干蛋白,如磷酸盐在冷冻过程中pH会改变,醋酸缓冲液在冻干过程中有可能会挥发,盐类保护剂会降低塌陷温度。因此需要同时评估配方信息和冻干过程,以最大限度地减少蛋白质聚集。


参考文献

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