导语：

补料作为fedbatch的营养补充剂，一般由消耗量较大的成分组成，如氨基酸、维生素等，其组分浓度高，渗透压高，在批次补料中至关重要，开发极具挑战性，需要恰当的成分，适宜的浓度，所谓艺术难在平衡，在补料开发上亦是如此。目前市面上的商业化补料种类并不多，市场基本被业界的三巨头（Gibco、Hyclone、Merck）垄断，迫于进口产品居高不下的价格，以及未来对于持续性供货的担忧，国产化补料已经顺势崛起。

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补料的重要性

那补料到底有多重要，小编先贴组数据，选择一款顶尖的商业基础培养基进行batch培养，同时使用商业化补料进行fedbatch作为对照组，试验细胞为表达某双抗的CHO-K1单克隆细胞株。

没有什么比数据更有说服力的了。Batch培养的细胞也有生长对数期、平台期和凋亡期，但凋亡期活率下降很快，12天活率仅剩82.4%，表达量是1.24g/L，再看对照组，第11天的表达量达到4.52g/L，第14天活率还有88%。可见补料在细胞培养及蛋白表达上的重要性。接下来小编又换了一个基础培养基（皓阳培养基），进行了相同的实验。

很明显，换了基础培养基后，补料仍旧不可或缺，但是这次使用皓阳基础培养基后，细胞生长的状态稍有改善，第11天的表达量有2.91g/L，能达到对照组的61%，只是从11天开始表达量原地不动，细胞只存活，不表达，也实在是无米可用。两个小实验对比可以发现，同样是基础培养基batch培养，生长及表达差距甚远，可能是基础中不同的组分及浓度造成了这个差异，到底是哪些成分的浓度差异导致，由于商业基础培养基的成分不明确，这里只能是一个迷。

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补料的搭配组合

一般补料为一个主体补料搭配一个碱性补料，碱性补料成分比较清晰，为几个难溶性氨基酸，如酪氨酸等。小编用仅含氨基酸、维生素和几个盐的补料（皓阳补料），以皓阳培养基为基础，与上述商业化补料进行了比对研究。

使用皓阳基础培养基仅补料商业补料，不补碱性补料，最后表达量为2.65g/L，与batch试验中的结果相当甚至更低，前期细胞生长与活率维持与另两组相似，后期维持很差，结束时活率甚至低于batch水平，表达量结果与batch相似，第11天后就停止表达，猜测是商业化补料中完全不含碱性补料中的某个或某几个氨基酸，导致细胞前期能利用基础中的含量进行生长和适当的表达，后期不断补入的营养成分由于无法利用反而成为了负担。再看皓阳补料，不补碱性补料后，表达量能达到5.36g/L，而补碱性补料后表达量为6.04g/L，比例达到88.7%，可能因为开发补料中含一定浓度的难溶性氨基酸，但浓度又不够，有文献报道过，将正常补料中的半胱氨酸浓度降低15%后，抗氧化物谷胱甘肽和牛磺酸等会减少，导致细胞在后期维持氧化还原的能力大大降低，活率下降，最终导致蛋白表达下降，这与本实验结论一致。

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补料对titer影响

皓阳补料第14天表达量有6.04g/L，能达到商业补料90%以上的水平，胜利在望，小编不能停下脚步，这次仍使用皓阳基础，将上述补料中20种氨基酸和11种维生素设了两个浓度，大部分氨基酸浓度差异较小，在2-5倍之间，个别特殊氨基酸如丙氨酸、甘氨酸酪氨酸等浓度设计差异较大，达到6-7倍以上，维生素的浓度差异较宽，在3倍至100倍之间不等，一共设计了32组PB（Plackett-Burman）试验，再加一组对照（33号，皓阳基础+商业补料）。

就不吐槽这个实验前期培养基配制工作有多复杂，结果却让小编大失所望，所有实验组均低于对照组，最高的只有5.15g/L，只有对照组的80.7%，而最低的为2.32g/L，连batch的表达水平都没达到，这细胞就是这么任性，营养不对胃口，就不吃也不吐。

虽然实验没有预期的结果，小编也没有挖掘到什么有价值的信息，只感觉添加不同浓度氨基酸和维生素对细胞生长影响没那么大，但对蛋白表达的影响却非常大，这次小编给自己减负，将氨基酸浓度卡住不动，单独对维生素进行了探索，但浓度范围作了适当的调整，高低在2-200倍之间，设计了12组PB与一组对照（13号，皓阳基础+商业补料）。

先看对照组，这个皓阳基础加商业补料的CP组合，从第二个实验的6.54g/L，到第四个实验的6.38g/L，再到本次的6.34g/L，可以说是非常的稳定。实验组活率到第11天为止基本一致，最后一天表现出了较大的差异，第14天最低活率是19%，最高活率有91%，活细胞密度情况相似，最后一天从22.7E6cells/ml到4.23E6cells/ml，也就是不同的维生素浓度对细胞后期的状态维持有较大的影响，分析得出结果对于活率密度维持及蛋白表达最重要的一个因子是氯化胆碱，这与文献报道一致。

04

补料定制开发对宿主的意义

虽然文献早有报道，但小编还是暗自惊喜，至少有两款能与商业补料媲美的补料， fedbatch最后第14天的表达量能达到6.4g/L，于是小编又精神抖擞，继续搬砖，这次用表达另一蛋白的CHOK1单克隆细胞，选取上述第11（皓阳补料1）和第12号补料（皓阳补料2）进行了试验。

皓阳基础搭配商业补料表现依旧出色，表达量为最高，达到4.86g/L，但皓阳补料无论是1或2，最后表达量仅有3.5g/L，有点不忍直视。所以可见，虽为同一宿主细胞，不同项目之间的差距，揭示了不同项目量身定制化开发的重要性。

经验分享与感悟

直到现在，因为细胞代谢的错综复杂，我们对它的认知仍是冰山一角，作为一名工艺人，在开发路上翻山越岭，披荆斩棘，只愿所有迷惑，皆为可解。

参考文献

1.Shinobu Kuwae , Ichiko Miyakawa , Tomohiro Doi , Development of a chemically defined platform fed-batch culture media for monoclonal antibody-producing CHO cell lines with optimized choline content. Cytotechnology .2018 Jun;70(3):939-948.       

2.Amr S. Ali , Rachel Chen , Ravali Raju , Rashmi Kshirsagar. Multi-Omics Reveals Impact of Cysteine Feed Concentration and Resulting Redox Imbalance on Cellular Energy Metabolism and Specific Productivity in CHO Cell Bioprocessing. Biotechnol J.2020 Aug;15(8):e1900565.

关于皓阳生物

杭州皓阳生物技术有限公司成立于2015年11月，是一家从事治疗性抗体和重组蛋白药物开发服务的国家高新技术企业。公司拥有抗体药物人源化和成药性分析、稳定细胞株构建、发酵工艺开发、纯化工艺开发、制剂处方开发、分析方法开发、抗体偶联药物（ADCs）开发、培养基定制开发等多个药物开发平台，建有完善的1000L规模原液和成品GMP生产线，能够提供从DNA到IND和临床Ⅰ、Ⅱ期样品生产一站式纯粹与专业CDMO服务。公司现有研发实验室面积5000平方米，总投资近亿元。自成立以来，公司为国内外多个新药研发企业提供生物药物技术研发服务，同时与多家知名医药公司达成战略合作。

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